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陈良怡团队发明超灵敏海森结构光超高分辨率显微镜

发布时间:2018-11-09 01:14:56 已有: 人阅读

  在每秒钟得到188张超高分辨率图像时,海森结构光显微镜的空间分辨率可以达到85纳米,能够分辨单根头发的1/600到1/800大小结构,而所需要的光照度小于常用的共聚焦显微镜光照度三个数量级。由于极低的光漂白以及光毒性,实现了100 Hz超高分辨率成像下连续采样10分钟得到18万张超高分辨率图像,或者是在1Hz超高分辨率成像下连续1小时超高分辨率成像基本无光漂白。

  与获得2014年诺贝尔化学奖的受激辐射损耗超高分辨率显微镜(STED)相比,海森结构光显微成像以极高的时间分辨率、极低的光毒性在活细胞超高分辨率成像方面占显著优势。例如,在观察细胞内囊泡与细胞质膜融合释放神经递质和激素过程中,海森结构光显微镜与STED显微镜(分辨率60纳米,每秒5幅左右;巫凌钢实验室2018年3月Cell上线的文章)都可以观察到囊泡融合形成的孔道;但是,海森结构光显微镜还解析出囊泡融合时四个不同中间态,包括囊泡打开3纳米小孔、囊泡塌陷、融合孔道维持和最后的囊泡与细胞质膜完全融合的过程,真正可视化膜孔道形成的全过程(图1)。

  图1 海森结构光显微镜解析囊泡融合孔道形成全过程。上图:实际的动态过程解析;下图:由实验结果得到的囊泡融合的四个中间态。

  此外,应用海森结构光显微镜,研究人员也实现了细胞“能量工厂”线粒体的超快超分辨成像,首次在活细胞中解析线粒体融合、时内嵴的活动,以及线粒体内嵴自身的重组装过程,也能够观察活细胞内内质网与线粒体发生相互作用时的动态变化(图2)。这是之前领域内无论是使用STED还是PALM/STORM超分辨率显微镜都无法观察到的现象,也凸显出超灵敏海森结构光显微镜对于观察光毒性敏感的细胞器如线粒体动态结构方面的独特优势。

  图2 海森结构光显微镜显微镜下观察到COS-7细胞中的内质网和线粒体相互作用的动态过程,蓝色的线粒体用MitoTracker Green标记,可以清楚辨识内嵴结构;品红色的是用SEC61-mCherry标记内质网结构。

  此项突破一方面是基于硬件自主设计的新偏振旋转玻片阵列、高精度的时序控制程序以及高数值孔径物镜的应用;另一方面是创新的重构算法,借鉴了人眼区分信号和噪声的机制,首次提出将生物样本在时空上连续,而噪声是完全随机分布的先验知识用于构建海森矩阵,指导超高分辨率荧光图像的重建。

  超灵敏海森结构光显微镜是目前成像时间最长、时间分辨率最高的超高分辨率显微镜,适用于各种细胞、不同探针的荧光成像。可以说,所有应用点扫描共聚焦显微镜的场景都可以使用海森结构光显微镜,因而具有广泛的应用前景。

  该论文的第一作者为北京大学黄小帅、华中科技大学范骏超和北京大学李柳菊,通讯作者为北京大学陈良怡、华中科技大学谭山。工作得到了国家自然科学基金委重大仪器研制基金、重大研究计划专项、科技部国家重点研发计划基金、重点基础研究发展计划和北京市自然科学基金委重点项目的资助。陈良怡、黄小帅等主创成员参与了早先发表于Nature Methods的高分辨率微型化双光子显微镜的研制,荣获2017年中国十大科学进展等荣誉。未来,他们将进一步实现微型化海森结构光的显微在体成像。

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